Primer acto: Iglesia Sant'Andrea della Valle
El fugitivo Cesare Angelotti entra buscando refugio a la capilla de la familia Attavanti en Sant 'Andrea della Valle. En ese instante entran el pintor Mario Cavaradossi y el sacristán. Mientras evalúan la pintura de Cavaradossi, un retrato de María Magdalena que combina la belleza de una rubia que frecuenta la iglesia, con la de su amada Tosca, Angelotti sale de su escondite y les explica que acaba de escapar del Castel Sant’Angelo, en donde había sido encerrado por Scarpia.
Angelotti se esconde nuevamente al oír que Tosca entra a la iglesia. Al ver a Cavaradossi Tosca le pregunta que con quién estaba por qué le pareció oír voces, a lo que el pintor responde tranquilizándola. Tosca le reclama con recelo, al reconocer a la marquesa Attavanti en el retrato, pero acepta su explicación y se va, no sin antes pedirle que le cambie el color de ojos al retrato. De repente suenan unos cañones y así todos se dan cuenta de que la policía ya sabe acerca del escape de Angelotti. Cavaradossi se lleva al fugitivo a su casa para darle refugio y cuando se marchan no alcanzan a ver al Sacristán, quien trae la noticia de que Napoleón Bonaparte ha sido derrotado en la Batalla de Marengo.
La felicidad del Sacristán se ve interrumpida cuando entra Scarpia, el jefe de policía de Roma, en busca de Angelotti. Seguido de Scarpia, entra Floria Tosca buscando a Cavaradossi desesperada. Al ver el estado de la cantante, el jefe de la policía le insinúa que Cavaradossi le está siendo infiel y al oír esto Tosca decide ir a buscarlo a su casa. En ese momento, Scarpia le ordena a Spoletta que la siga y busque al fugitivo. Tosca se va y Scarpia muestra con lascivia sus deseos de conquistar a Tosca en medio del ‘Te Deum’.
